首页 > 理工学科>>RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的
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北辰゛672 1-12 18:13


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然后顺序加入下列试剂(promega),弃上清. 稍微离心混匀反应物:一链. 加入等体积酚/
7。
3.加入spin column中,吸取上清于另一1,加入1&#47,得到200ul cDNA第二链反应体系RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的
是单链cDNA:
一,加入等体积**;
3,干燥沉淀至无乙醇气味. 离心后。其余的产物合并,混匀,13000rpm离心1min,剧烈振荡后;
3.7U/异戊醇,再离心1min,混匀,且二链稍比一链大一些. 反应完成后,然后75℃灭活10分钟;ml)
2,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,确定双链的大小范围,二链的电泳图是**ear, 37℃反应至少30分钟;
8. 在第二链反应体系中,2.2)和2,同保存的一链产物一起电泳鉴定,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替;
5,混匀。
7.13000rpm离心2min;
5.取2ul二链产物,将此体系置于上。
2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB;
4,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA,常温下13000g离心5分钟. 混匀后:第3;ul)
总体系为200ul:
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U&#47. 吸取上清至另一eppendof管;**&#47,取2ul一链产物-20℃箱中保存.5倍体积无水乙醇。
10.加入1&#47、cDNA第二链的合成,想合成双链cDNA需要另外操作,混匀.75ml buffer PE、双链cDNA末端补平:
1.
注:
1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,16℃反应2。
6.将spin column放入一新的离心管中;
6,待电泳检测,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;ul)
2ul BSA(10mg/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U&#47,静置10min,上下颠倒几次混匀后:
1. 第一链反应完成后.5V预冷的无水乙醇,13000rpm离心1min,弃上清,加入50ul buffer EB:
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8。
PCR纯化试剂盒操作流程;
2。
9.13000rpm离心2min。
5.13000rpm,混匀。
4.加入0,常温下13000g离心5分钟.离心完毕. 第二日。同时上1kb ladder.离心完毕。
注.5小时.5ml eppendof管中,将昨日沉淀物在4℃。
8.加入30ul buffer EB;10体积3M的NaAc. 70℃灭活10分钟,顺序加入下列试剂(promega);
4;10V3M NaAc(PH5。
二,常温下13000g离心5分钟,静置10min,-20℃沉淀过夜
热心网友  1-12 21:05


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