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北辰゛672 1-12 18:13


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RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的
是单链cDNA,想合成双链cDNA需要另外操作:
一、cDNA第二链的合成:
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于上;
5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder,确定双链的大小范围。
注:一链,二链的电泳图是**ear,且二链稍比一链大一些。
二、双链cDNA末端补平:
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymera尝範佰既脂焕拌唯饱沥se(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/**/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积**,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程:
1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。
2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀。
3.加入spin column中,13000rpm离心1min。
4.加入0.75ml buffer PE,13000rpm离心1min。
5.13000rpm,再离心1min。
6.将spin column放入一新的离心管中,加入50ul buffer EB,静置10min。
7.13000rpm离心2min。
8.加入30ul buffer EB,静置10min。
9.13000rpm离心2min。
10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。
热心网友  1-12 21:05


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